Keragaman Kandungan dari Extracellular Vesicle
Pembicara: Dolores DiVizio Cedars
EVs sangat heterogen dalam ukuran, fungsi, biogenesis, dan mekanisme komunikasi dengan sel target. Saat ini, populasi EVs terbaru disebut sebagai Large Oncosomes (LOs), yang berasal dari pelepasan selaput membran non-apoptosis sel. Namun, ini mungkin diklasifikasikan secara berbeda dari kategori exosome karena ukurannya yang besar. Proses ini dimodulasi oleh hilangnya formin 3 terkait Diaphanous (DIAPH3), yang menghasilkan aktivasi jalur kinase RhoA-ROCK, mekanisme utama yang mengatur perubahan sel kanker dari mesenkim ke amoeboid. Perubahan biomarker kanker sebelum dan sesudah terapi MSC atau CM dapat digunakan untuk menentukan efektivitas terapi.
Biogenesis yang berbeda dan kategori EVs (turunan endosom versus non endosom) dapat menjadi salah satu sumber utama dari bervariasinya kandungan dari EVs. Oleh karena itu, dalam beberapa tahun terakhir, beberapa upaya untuk menganalisis konten dari EVs telah dilakukan secara komparatif dengan menggunakan alat spektrometri setelah pemisahan EVs menggunakan sentrifugasi / filtrasi / gradien kepadatan. EVs yang berukuran besar akan mengapung dalam 1,10-1,15 g/ml iodixanol centrifugation gradients.
Gambar di atas menunjukan heterogenitas dari EVs yang diisolasi dari media sel kanker prostat dengan ultrasentrifugasi pada 10.000 x g.
Metode untuk Pemisahan EVs dapat menghasilkan Berbagai Spesifisitas dan Jumlah yang diperoleh
Pembicara: An Hendrix
Pemisahan didasarkan pada ukuran, kepadatan, dan immunophenotyping. A. Dalam sentrifugasi diferensial, pemisahan didasarkan pada ukuran, dan EVs berukuran besar (abu-abu) terkumpul lebih awal di bagian bawah tabung dan pada sentrifugasi lebih rendah untuk isolasi EVs yang berukuran kecil (hijau). Komponen yang dapat larut tidak terpengaruh oleh sentrifugasi, tetapi partikel non-EV seperti lipoprotein dan agregat protein dapat terisolasi dengan EVs. B. Dalam sentrifugasi gradien kepadatan, pemisahan didasarkan pada kepadatan, dan EVs akan melakukan perjalanan berdasarkan keseimbangan kepadatan. Partikel non-EVs seperti lipoprotein dapat bergabung dengan EVs karena kepadatan atau interaksi yang serupa. Komponen terlarut dengan kerapatan relatif tinggi terhadap gradien akan terkumpul di dasar tabung. C, Kromatografi berdasarkan jenis ukuran menggunakan matriks berpori (lingkaran bertitik) yang memisahkan berbagai jenis EVs berdasarkan ukuran. Komponen terlarut dan partikel yang lebih kecil dari ukuran cutoff masuk ke matriks berpori, sedangkan EVs dan partikel yang lebih besar dari ukuran cutoff tidak masuk ke matriks berpori. Akibatnya EVs dan partikel yang lebih besar dari ukuran cutoff akan terelusi terlebih dahulu dari komponen terlarut dan partikel yang lebih kecil dari ukuran cut-off. D. Dalam ultrafiltrasi, protein dan partikel terlarut yang lebih kecil dari batas ukuran (≈105 kDa) didorong melalui filter, dan EVs dikumpulkan di filter. E, Dalam uji imunokaptur, EVs ditangkap berdasarkan imunofenotipenya. EVs ditangkap menggunakan antibodi monoklonal (mAb) yang diarahkan ke antigen yang terpapar hanya pada EVs yang ditargetkan (hijau). F. Dalam presipitasi, penambahan agen pengendap menginduksi penggumpalan EVs, partikel non-EVs, dan protein terlarut. Gumpalan akan mengendap, dan sedimentasi dapat dipercepat dengan sentrifugasi.
Tidak ada satu metode isolasi yang dibahas yang dapat mengisolasi EVs dengan sempurna baik dengan konsentrasi tinggi maupun dengan kemurnian yang tinggi. Setiap metode memiliki kekurangan dan kelebiha sehingga diperlukan kombinasi keduanya. Akan tetapi, metode yang paling umum digunakan adalah ultrasentrifugasi dan Immuno capture.
Penanda EVs UNTUK FLOW CYTOMETRY
Pembicara: Xiaomei Yan
Dengan menggunakan penyortir sitometrik berkecepatan tinggi, EVs dapat diisolasi dengan kecepatan tinggi sehingga peneliti dapat memisahkan, mengisolasi, dan mengkarakterisasi EVs pada proses produksi. EVs yang terkontaminasi dengan protein, pewarna atau agregat antibodi dengan ukuran yang sama, tetapi massa yang berbeda, dapat dikarakterisasi berdasarkan sifat fisik ini menggunakan ultrasentrifuge analitik. Tidak semua EV dapat diberi label fluoresens dengan fluorofor lipofilik bahkan pada kondisi pelabelan jenuh. Antibodi yang tidak terikat dapat menggabungkan diri dan membentuk partikel, menyebabkan hasil latar belakang yang tinggi sehingga hasil EVs yang diperoleh tidak terlalu murni dan akan sulit untuk dianalisa. Oleh karena itu, ultrasentrifugasi biasanya digunakan untuk menghilangkan pewarna atau antibodi yang tidak berikatan dengan EVs.
Saat ini, untuk melabel EVs dapat menggunkan metode yang update yaitu nano-flow cytometer (nFCM) yang memungkinkan analisis multiparameter dari hanya satu EV dengan ukuran 40 nm diisolasi dari plasma, salah satu cairan tubuh yang paling sulit untuk digunakan. Karena penanda CD9, CD63 dan CD81 ada dalam matriks plasma, fenotipe partikel tunggal EV menawarkan keuntungan yang berbeda dalam validasi EV dibandingkan dengan metode pada umumnya, seperti analisis Western blot.
Penggambaran EVs menggunakan TEM
Pembicara: Guillaume Van Niel
Gambar di atas menjelaskan berbagai metode yang digunakan untuk pengambilan gambar EV berdasarkan ukuran dari jenis EVs. Setiap metode penggambaran EVs memiliki batas resolusi dari hasil penangkapan gambar EVs. Metode yang berbeda dapat diterapkan untuk penangkapan gambar EVs berdasarkan kategori EVs dan target yang diinginkan (misalnya sel, jaringan, organ).
Transmission Electron Microscopy (TEM) adalah instrumen yang paling banyak digunakan untuk memantau kualitas dan kemurnian EVs dikarenakan kemampuannya untuk membedakan EV dari partikel non-EV yang berukuran serupa. Sampel yang disiapkan untuk pengambilan gambar menggunakan TEM pertama-tama harus di fiksasi dan didehidrasi. TEM menggunakan electron beams untuk menerangi pengamatan. EV yang diamati oleh TEM,
Cryo-EM memberikan keuntungan besar dibandingkan TEM konvensional, resolusi keseluruhan yang lebih baik. Namun, cryo-EM tidak banyak digunakan karena ketersediaan dan waktu yang dibutuhkan untuk menganalisis satu sampel. Keuntungan dari Cryo-EM dikarenakan bentuk asli dari EVs sangat dipertahankan di suhu yang sangat rendah (di bawah – 175 ° C). Oleh karena itu, ukuran rata-rata EVs akan terlihat lebih besar jika dibandingkan dengan metode EM lainnya.
Atomic force microscopy (AFM) menggunakan probe yang dibuat dari silikon atau silikon nitrida untuk memindai melalui permukaan spesimen. Dengan merekam posisi probe selama pemindaian, AFM menghasilkan gambar topografi dari sampel. AFM memiliki batas resolusi sekitar 1 nm, yang memungkinkan kuantifikasi dan pencitraan sebagian besar dari jenis EVs.
